引物是
PCR反應(yīng)體系構(gòu)建的關(guān)鍵,PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上任何一段模板DWA序列,就能按其設(shè)計互補的寡桉苷酸鏈做引物,利用PR就可將模板DWA在體外擴增。
PCR反應(yīng)體系構(gòu)建中引物的設(shè)計原則：
1、引物長度:15-30bp ，常用為20bp左右；
2、引物擴增跨度:以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段；
3、避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補，不然會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴增條?。?/div>
4、引物堿基:G+C含量以40-60M為宜，G+C 太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGc一般隨機分布，避免5個以上的嘌呤或咤啶核苷酸的成串排列；
5、引物3端的堿基,特別是末及倒數(shù)第二個堿基,應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗；
6、引物中有或能加上合適的酶切位點,被擴增的靶序列一般有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很友好；
7、引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量以每條引物0.1-1umol或10-100pmo1,以較低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為準，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。
更新時間：2020-11-16
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